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BRDU對(duì)研究細(xì)胞動(dòng)力學(xué)有著重要意義

Brdu是一種合成的胸苷類似物，在DNA復(fù)制的S期可替代胸腺嘧啶核苷選擇性結(jié)合到細(xì)胞DNA中。從而檢測(cè)細(xì)胞DNA合成和標(biāo)記細(xì)胞分裂，凋亡等行為。在遺傳研究中Brdu可通過活體注射或細(xì)胞培養(yǎng)添加，然后使用抗Brdu的單克隆抗體進(jìn)行特異性標(biāo)記，ICC或IHC法染色顯示增殖細(xì)胞。另外，還能同時(shí)結(jié)合其它細(xì)胞標(biāo)記物，雙重染色，來判斷增殖細(xì)胞的種類，增殖速度等，對(duì)研究細(xì)胞動(dòng)力學(xué)有著重要意義。

使用方法

1. Brdu配制

用1X DPBS充分溶解適量的Brdu配置成濃度為10 mg/ml的母液，0.22um濾器過濾除菌后，按照0.5ml/管的量分裝放在-20℃或者-80℃長期保存，避免反復(fù)凍融。Brdu儲(chǔ)存液再融化后，4℃可穩(wěn)定存放一周。

2. 在體Brdu標(biāo)記

腹腔注射法（常用）：無菌的10 mg/ml（溶于DPBS）適合用于體內(nèi)注射用。按照100-200μl（1-2 mg）Brdu的量腹腔注射到小鼠體內(nèi)。注意：一般注射后0.5 h后在小腸、胸腺和骨髓瘤處就能檢測(cè)到Brdu。在注射后24 h內(nèi)幾乎所有組織都能檢測(cè)到Brdu。根據(jù)自身的實(shí)驗(yàn)體系，在合適的時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物，摘除待研究的組織。使用冰凍切片或者石蠟包埋的方法進(jìn)行組織處理和切片制備。然后進(jìn)入后續(xù)的IHC染色步驟。

3. 體外Brdu標(biāo)記（培養(yǎng)原代細(xì)胞或者細(xì)胞系）

推薦使用濃度：10 μM Brdu（稀釋于培養(yǎng)液）

1）在96孔板上按標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；

2）Brdu工作液的準(zhǔn)備：用組織細(xì)胞培養(yǎng)液按照1:30的比例稀釋儲(chǔ)存液得到1mM Brdu工作液。然后取10μl  1 mM Brdu溶液直接加入1 ml培養(yǎng)液即得到10 μM  Brdu工作液。

3）按100 μl/孔Brdu工作液的量進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記，37℃孵育60 min~過夜。同時(shí)設(shè)置非Brdu標(biāo)記的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。注意：最佳的孵育時(shí)間取決于細(xì)胞增殖速度以及需要達(dá)到的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?。比如，?duì)于快速增殖細(xì)胞（如HL-60）有效孵育時(shí)間為30-45min；對(duì)于原代細(xì)胞（如未受外源刺激培養(yǎng)的外周血淋巴細(xì)胞）孵育時(shí)間可能需要24 h。細(xì)胞密度需小于2x106 /ml。

4）制備單細(xì)胞層玻片，使用以下任何一種方法：

a.細(xì)胞離心涂片制備：使用細(xì)胞離心涂片機(jī)，將100μl標(biāo)記好的細(xì)胞（濃度為：1-2x106 /ml）直接離心poly-L-lysinee包被的玻片上，風(fēng)干。

b.細(xì)胞涂片制備：取一小滴標(biāo)記好的細(xì)胞懸液于poly-L-lysine包被玻片的一端，然后用第二個(gè)干凈玻片將其均勻涂布成一薄層。室溫風(fēng)干。

5）將玻片置于70%冰乙醇放在-20℃下固定20-30 min。

6）PBS清洗細(xì)胞3次，每次5min。

7）加入1.5M HCl中室溫孵育30 min。注意：DNA的變性對(duì)于Brdu染色的成功至關(guān)重要。

8）吸去HCl，PBS清洗2次，每次5min。

9）進(jìn)入后續(xù)ICC染色步驟。

4. 體外Brdu標(biāo)記（組織薄片）

1）Brdu工作液的準(zhǔn)備：用組織細(xì)胞培養(yǎng)液按照1:30的比例稀釋儲(chǔ)存液得到1mM Brdu工作液。然后取10 -20μl 1 mM Brdu溶液直接加入1 ml組織培養(yǎng)液即得到最終工作液。確保有足夠的工作液（37℃溫?zé)幔?浸泡組織。

2）在溫?zé)岬呐囵B(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行組織切片，注意維持組織的活力。

3）轉(zhuǎn)移組織薄片至預(yù)裝有10 ml Brdu標(biāo)記液的15 ml離心管內(nèi)。置于37℃，CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。孵育時(shí)間取決于組織薄片類型以及需要達(dá)到的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模ǔＳ玫臑?-4 h）。

4）37℃ PBS清洗組織薄片，每次5 min。

5）使用標(biāo)準(zhǔn)的冰凍切片或者石蠟包埋切片的方法固定組織并進(jìn)行后續(xù)其它染色標(biāo)記。